RÉSUMÉ

Il existe un besoin de méthodes d'échantillonnage standardisées, efficaces et pratiques pour étayer de vastes études en population des microbiomes épithéliaux internes et externes de la mamelle des bovins. L'objectif principal de cette étude était d'évaluer différents dispositifs d'échantillonnage pour l'isolement de l'ADN microbien provenant de l'épithélium interne et externe du trayon. Les objectifs secondaires étaient d'étudier et de comparer la diversité microbienne des microbiomes épithéliaux externes et du canal du trayon en utilisant des approches de séquençage métagénomique d'amplicon et de fusil de chasse. Pour atteindre ces objectifs, nous avons recruté un échantillon de commodité de 24 vaches laitières Holstein et prélevé des échantillons de l'épithélium externe à la base de la mamelle, de l'épithélium du baril de trayons externe, de l'épithélium de l'apex du trayon externe et de l'épithélium du canal du trayon. L'ADN extrait a été quantifié et soumis à une amplification par PCR de la région hypervariable V4 du gène de l'ARNr 16S et séquencé sur la plateforme Illumina MiSeq (Illumina Inc., San Diego, CA). Un sous-ensemble d'échantillons a été soumis à un test métagénomique de fusil de chasse peu profond sur la plate-forme Illumina HiSeq. Pour les échantillons prélevés sur l'épithélium du trayon externe, nous avons constaté que les carrés de gaze produisaient systématiquement plus d'ADN que les écouvillons, et que l'indice de diversité réciproque de Simpson était plus élevé pour la gaze que pour les écouvillons. Les échantillons épithéliaux du canal du trayon présentaient une diversité significativement plus faible que les sites d'échantillonnage externes, mais il n'y avait pas de différences significatives de diversité entre l'apex du trayon, le barillet du trayon et la base des échantillons de pis. Il y avait, cependant, des différences dans la distribution microbienne et les abondances de bactéries spécifiques à travers les surfaces épithéliales externes. La proportion de lectures de séquence de fusil de chasse classées comme Bos taurus était très variable entre les sites d'échantillonnage, allant de 0,33% dans les échantillons de l'apex des trayons à 99,91% dans les échantillons du canal des trayons. Ces résultats indiquent que les carrés de gaze doivent être envisagés pour étudier le microbiome de l'épithélium externe du pis bovin, en particulier si le rendement en ADN doit être maximisé. En outre, la proportion relative d'ADN hôte / non hôte présent dans les échantillons prélevés sur l'épithélium interne et externe du trayon doit être prise en compte lors de la conception d'études utilisant le séquençage métagénomique par fusil de chasse.

ABSTRACT

There is a need for standardized, efficient, and practical sampling methods to support large population-based studies of the internal and external epithelial microbiomes of the bovine udder. The primary objective of this study was to evaluate different sampling devices for the isolation of microbial DNA originating from the internal and external teat epithelium. Secondary objectives were to survey and compare the microbial diversity of external and teat canal epithelial microbiomes using amplicon and shotgun metagenomic sequencing approaches. To address these objectives, we enrolled a convenience sample of 24 Holstein dairy cows and collected samples from the external epithelium at the base of udder, the external teat barrel epithelium, the external teat apex epithelium, and the teat canal epithelium. Extracted DNA was quantified and subjected to PCR amplification of the V4 hypervariable region of the 16S rRNA gene and sequenced on the Illumina MiSeq platform (Illumina Inc., San Diego, CA). A subset of samples was subjected to a shallow shotgun metagenomic assay on the Illumina HiSeq platform. For samples collected from the external teat epithelium, we found that gauze squares consistently yielded more DNA than swabs, and Simpson's reciprocal index of diversity was higher for gauze than for swabs. The teat canal epithelial samples exhibited significantly lower diversity than the external sampling locations, but there were no significant differences in diversity between teat apex, teat barrel, and base of the udder samples. There were, however, differences in the microbial distribution and abundances of specific bacteria across external epithelial surfaces. The proportion of shotgun sequence reads classified as Bos taurus was highly variable between sampling locations, ranging from 0.33% in teat apex samples to 99.91% in teat canal samples. These results indicate that gauze squares should be considered for studying the microbiome of the external epithelium of the bovine udder, particularly if DNA yield must be maximized. Further, the relative proportion of host to non-host DNA present in samples collected from the internal and external teat epithelium should be considered when designing studies that utilize shotgun metagenomic sequencing.

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